血清分離實(shí)驗(yàn)?zāi)哪苌俚牧怂?

發(fā)布時(shí)間：

2021-03-31

概要：

離心機(jī)是血液完全凝固重要環(huán)節(jié),離心要求采用水平式離心機(jī)。離心機(jī)被廣泛應(yīng)用于血清分離實(shí)驗(yàn)。采血后立即輕輕倒轉(zhuǎn)采血試管4~5次混勻標(biāo)本,等待標(biāo)本充分凝固需要放置30min,離心半徑200px,離心機(jī)離心速度維持在3500~4000r/min離心10min。

　　離心機(jī)被廣泛應(yīng)用于血清分離實(shí)驗(yàn)。

　　血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成，各行使其重要的功能。

　　血液完全凝固和離心條件是至關(guān)重要的兩個(gè)環(huán)節(jié),離心要求采用水平式離心機(jī)。具體操作步驟是:采血后立即輕輕倒轉(zhuǎn)采血試管4~5次混勻標(biāo)本,等待標(biāo)本充分凝固需要放置30min,離心半徑200px,離心機(jī)離心速度維持在3500~4000r/min離心10min。血清與血凝塊完全被分離膠分離,血清標(biāo)本可直接上機(jī)檢測(cè)或轉(zhuǎn)移至儀器配套試杯中。具備這個(gè)條件才能制備出高品質(zhì)血清標(biāo)本，說(shuō)明分離膠效果好。

　　鹽析后蛋白質(zhì)沉淀經(jīng)水溶后，特點(diǎn)是保持蛋白質(zhì)生物學(xué)活性，因此，鹽析法是研究蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和功能的最常用方法。除鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、柱層析法和超速離心法等也是蛋白質(zhì)分離的常用方法。

　　實(shí)驗(yàn)器材和試劑

　　1．器材：10ml具塞刻度試管、離心機(jī)、離心管、小試管、5ml吸管、滴管2支、培養(yǎng)皿3套、醋酸纖維薄膜、點(diǎn)樣器、電泳槽、電泳儀、1.0×20cm層析柱。

　　2．試劑：

　　(1) 葡聚糖凝膠Sephadex G-25：稱10g SephadexG-25，加200ml 0.02mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液溶脹24小時(shí)。

　　(2) 生理鹽水：稱取分析純NaCl 0.89g，蒸餾水稀釋至100ml。

　　(3) 飽和硫酸銨溶液：25℃時(shí)稱取(NH４)２SO4約767g,溶解至1000ml蒸餾水中，至不能完全溶解為止，即為飽和硫酸銨溶液。

　　(4) 巴比妥緩沖液(pH 8.6)：稱取巴比妥鈉15.458g．巴比妥2.768g，蒸餾水定容至1000m1。

　　(5) 氨基黑10B染色液：稱取氨基黑10B 0.5g,加入100ml漂洗液不斷振搖,直到完全溶解。

　　(6) 漂洗液：取95％乙醇450ml，冰醋酸100m1，混勻后，用蒸餾水稀釋到l000ml。

　　鹽析沉淀蛋白質(zhì)：

　　取10 m1具塞刻度試管1支，加入血清溶液 2.5ml，緩慢加進(jìn)等量飽和(NH4)2SO4溶液，充分搖勻，見(jiàn)有沉淀析出，靜置10min，用雙層濾紙過(guò)濾，棄去沉淀，取濾液。

　　蛋白質(zhì)分子能穩(wěn)定存在于水溶液中是因?yàn)橛袃蓚€(gè)穩(wěn)定因素：水化膜和表面電荷。當(dāng)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素破壞時(shí)，蛋白質(zhì)分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白質(zhì)分子沉淀析出的方法很多，根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素破壞的不同有中性鹽析法、有機(jī)溶溶劑法、重金屬鹽法以及生物堿試劑法等。鹽析法是以中性鹽如硫酸銨((NH４)２SO4)等對(duì)蛋白質(zhì)作用破壞蛋白質(zhì)表面水化膜而使蛋白質(zhì)相互聚集而析出。不同的蛋白質(zhì)沉淀需要的中性鹽濃度不同，在不同鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度不同。球蛋白在半飽和狀態(tài)下發(fā)生沉淀，而請(qǐng)蛋白在完全飽和狀態(tài)下沉淀，利用此特性可把蛋白質(zhì)分段沉淀下來(lái)，此種鹽析法稱分段鹽析。

　　此次實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

　　1、只有經(jīng)過(guò)嚴(yán)格培訓(xùn)的人員才能進(jìn)行離心機(jī)操作。

　　2、操作時(shí)應(yīng)戴手套以及眼睛和黏膜的保護(hù)裝置。

　　3、規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)可以避免或盡量減少噴濺和氣溶膠的產(chǎn)生。血液和血清應(yīng)當(dāng)小心吸取，而不能傾倒。嚴(yán)禁用口吸液。

　　4、移液管使用后應(yīng)完全浸入適當(dāng)?shù)南疽褐小Ｒ埔汗軕?yīng)在消毒液中浸泡適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，然后再丟棄或滅菌清洗后重復(fù)使用。

　　5、帶有血凝塊等的廢棄標(biāo)本管，在加蓋后應(yīng)當(dāng)放在適當(dāng)?shù)姆缆┤萜鲀?nèi)高壓滅菌和／或焚燒。

　　6、應(yīng)備有適當(dāng)?shù)南緞﹣?lái)清洗噴濺和溢出標(biāo)本。

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